ATAC-seq即染色质开放性检测,是基于高通量测序手段研究染色质转座酶可接近性的一种技术，可以获得全基因度尺度上处于开放状态的染色质区域活跃转录的调控序列，从而分析潜在的活跃转录因子及其靶基因，目前已广泛应用于病理生理调控机制、药物靶点发现、耐药机制探究等方向，与转录组结合可构建转录因子协同调控网络；ONT全长转录组是利用ONT长读长测序平台，无需打断，完整测到转录本全长序列，相比于常规转录组，可在准确分析转录本水平的表达量的同时，对序列结构进行准确解析，得到可变剪切、可变多聚腺苷酸、融合基因等分析结果。
四川省人民医院龚波研究员在Journal of Genetics and Genomics杂志发表题为“ Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase FAM20C as an oncogene in glioma ” 的研究论文，结合ATAC-seq与ONT全长转录组，揭示FAM20C在神经胶质瘤中的致癌作用等。
中文标题：全长转录组及ATAC协助解析神经胶质瘤致癌基因FAM20C调控
英文标题：Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase FAM20C as an oncogene in glioma
期刊名称：Journal of Genetics and Genomics
合作单位：四川省人民医院
研究对象：神经胶质瘤及配套癌旁组织
测序技术：ONT全长转录组+ATAC-seq+qPCR+免疫组化等
太阳集团电子游戏为该研究提供了全长转录组及ATAC等测序技术服务。
研究背景
神经胶质瘤是神经系统中最常见的原发性肿瘤，攻击力极强，约占所有脑肿瘤的80%，目前主要的癌症治疗方案，包括手术切除、放疗和化疗，都会导致预后不良和高死亡率，很难对胶质瘤提供理想的治疗效果，因此现在迫切需要探索新的有效策略以及胶质瘤治疗的潜在治疗靶点。长读长RNA测序技术已应用在包括肝细胞癌和非小细胞肺癌等多种癌症类型中，ATAC-seq也已经应用于胰腺癌、胃癌和乳腺癌等多种肿瘤研究中。FAM20C是一种可调节分泌途径中的各种网络的分泌蛋白，主要负责矿化激酶，然而越来越多的研究表明，FAM20C 与包括包括乳腺癌、膀胱癌和结直肠癌在内的多种癌症广泛相关。
材料方法
材料：神经胶质瘤及配套癌旁（病灶旁2cm处）组织样本
方法：ONT全长转录组+ATAC-seq+qPCR+免疫组化等
研究结果
用三对胶质瘤及癌旁组织作为发现组进行了ONT全长转录组测序，之后又用另外6对胶质瘤及癌旁组织作为鉴定组进行了ONT全长转录组测序，两次测序中发现共有差异基因（DEG）503 个，在癌症相关通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和Ras信号通路中显著富集。另外，差异基因也在神经元活动通路中富集，表明神经元激活与神经胶质瘤有关，这与最近的研究一致，已经有研究证明，突触粘附分子神经粘附蛋白-3（NLGN3）的活性依赖性裂解和分泌介导了脑癌神经调控，有助于通过PI3K-mTOR途径促进神经胶质瘤增殖，而PIK3CA 变体已被证明在神经胶质瘤发生过程中选择性地启动大脑过度活跃，并在神经元环境的肿瘤重塑中增加活性发挥重要作用。因此，鉴定出的神经元活动相关DEGs为神经元和胶质瘤细胞之间串扰的前瞻性研究奠定了基础。
APA分析结果显示，在发现数据集以及鉴定数据集中，共鉴定到了12492个APA事件，两组各自有97例和260例APA事件显示出显著差异，且各有52例和65例APA在两组中显示存在多A位点，为了分析APA事件与差异表达基因的关系，结果中比较了差异APA及差异基因集合，发现大部分共有基因在神经胶质瘤中APA 信号和表达都呈现较低水平，这意味着更多的多聚腺苷酸化可能有助于 mRNA 的稳定性。神经胶质瘤中的APA事件与基因表达高度相关，表明APA事件在这些基因的失调和胶质瘤发病机制中起着关键作用。
为了探究神经胶质瘤中基因的转录调控，对发现数据集中的6个样本进行了ATAC测序，鉴定出与1129个基因关联的1176个差异峰（DPs），如预期所料，大多数DPs分布在基因结构的近端启动子区域，结果中观察到两个增加的Glypican 1（GPC1）DPs信号，其中一个位于启动子中，另一个位于第一个内含子区域。此外，在神经胶质瘤样本中还观察到蛋白酪氨酸磷酸酶受体 B 型 （PTPRB） 的 DP 信号降低（内含子区），随后将1129个DPs相关基因和503个常见DEGs进行比较，找到交集的22个基因，结合CGGA数据库分析对应表达，发现有16个基因显著差异表达，针对这16个基因的患者生存率分析发现，仅 RAB3A 和 FAM20C 同时具有预后及临床的意义，另外这22个基因中，NPTN基因也是目前研究热度较高的基因。通过qRT-PCR和免疫组化（IHC）染色验证了NPTN和FAM20C在我们收集的神经胶质瘤样本中的表达，在胶质瘤较高阶段的样品中观察到NPTN的表达显着降低，相反，FAM20C在神经胶质瘤样本中的表达显著增加，特别是在IV期，IHC 染色进一步验证了 NPTN 通过抑制神经胶质瘤进展到晚期来抵消 FAM20C 的致癌功能。
最后，为了探索与神经胶质瘤中 FAM20C 和 NPTN 失调相关的转录因子，从在线数据库 ChIP-Atlas 下载组蛋白标记物（H3K4me 和 H3K27ac）的 ChIP 数据，并用TCGA数据集验证这些转录因子在FAM20C或NPTN中的表达，最终结果表明，在TCGA数据集中，REST与FAM20C的相关系数最高。鉴定出两个反式活性因子（BRD4 和 REST）与 FAM20C 和 NPTN 均呈正相关。结合染色质可及性、TFs 结合位点和 APA 分析共同影响基因表达，结果表明，神经胶质瘤样本中NPTN的表达显著降低，而在神经胶质瘤中观察到的峰值信号增加。此外，神经胶质瘤中NPTN的APA数量明显小于对照组。因此，提出了APA编号在神经胶质瘤中NPTN基因表达的转录调控中占主导地位的假设，本研究开创了FAM20C在神经胶质瘤中的临床意义、体外功能和枢纽转录因子。值得注意的是，FAM20C 抗体显着消除了 FAM20C 异位表达引起的肿瘤大小增加，总之，本项研究证明了转录激活的 FAM20C 是一种致癌基因，对神经胶质瘤具有治疗意义。
参考文献：
Gong B, Liang Y, Zhang Q, Li H, Xiao J, Wang L, Chen H, Yang W, Wang X, Wang Y, He Z. Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase FAM20C as an oncogene in glioma. J Genet Genomics. 2023 Jun;50(6):422-433. doi:10.1016/j.jgg.2023.01.008. Epub 2023 Jan 25.
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