项目文章NEURO（IF:15.9) | 罕见病脊索瘤治疗新机制？单细胞空间组学来揭示！

2024年1月，湖南省南华大学衡阳医学院附属第一医院在国际学术期刊Neuro-Oncology发表一项重要研究成果，题为：Integrating single-cell and spatial transcriptomics reveals endoplasmic reticulum stress-related CAF subpopulations associated with chordoma progression。该研究使用单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)、空间转录组学、批量 RNA-seq 和多重定量免疫荧光 (QIF) 来剖析脊索瘤中 CAF 的异质性、空间分布和临床意义。

文章标题：Integrating single-cell and spatial transcriptomics reveals endoplasmic reticulumstress-related CAF subpopulations associated with chordoma progression

期刊名称：Neuro-Oncology

影响因子：15.9

合作单位：湖南省南华大学衡阳医学院附属第一医院

研究部位：脊索瘤

研究方法：scRNA-seq、空间转录组学、RNA-seq、QIF等

太阳集团电子游戏为该研究提供了空间转录组测序服务。

研究背景

脊索瘤被认为是由原始脊索的残余物产生的，是一种罕见的局部侵袭性间叶性肿瘤。脊索瘤的年发病率约为百万分之 0.8，并且优先发生在骶骨和颅底区域。脊索瘤对传统化疗不敏感，目前的最佳治疗方法是初始最大手术切除辅以辅助放射治疗，这为患者提供了最佳的临床结果。然而，由于由于肿瘤的浸润性和邻近关键神经血管结构，根治性切除肿瘤具有挑战性。因此，许多患者在手术后出现局部肿瘤复发甚至转移，导致生活质量和长期生存不良。鉴于这一令人沮丧的事实，迫切需要揭示其分子生物学和分子生物学机制来开发出针对该疾病更有效的治疗方法。

实验材料

自 3 个原发肿瘤样本和 3 个复发肿瘤样本的 72 097 个单细胞以及作为对照的 3 个髓核样本进行了测序单细胞和空间转录组测序。对 126 名患者的总RNA-seq 测序。另外针对105名患者开展QIF试验。

1、scRNA-seq：收集了 6 份脊索瘤样本（包括 3 份原发肿瘤和 3 份复发肿瘤）和 3 份髓核标本进行 scRNA-seq。

2、Bulk RNA-seq：总共检索了 126 个肿瘤样本（包括 93 个原发肿瘤和 33 个复发肿瘤）进行总RNA 测序。

3、空间组学测序：三个新鲜肿瘤标本（包括 2 个原发肿瘤和 1 个复发肿瘤）用于 ST 测序。

4、QIF：QIF 使用 Opal 7 色手动 IHC 试剂盒（PerkinElmer，Waltham，马萨诸塞州）进行。

研究结果

1.单细胞转录组谱鉴定脊索瘤微环境中功能独特的 CAF 群体

该研究通过生成 6 名脊索瘤患者（包括 3 名原发性肿瘤和 3 名复发性肿瘤）和 3 名匹配的 LDH 患者组织的单细胞基因表达谱，总共获得72097个细胞，其中46987个细胞来自脊索瘤，25110个来自NP组织样本。如图1A-B所示，a总共鉴定了49个细胞簇，这些簇的注释导致了10种细胞类型的分离。被鉴定为上皮样细胞、成纤维细胞、T 细胞和 B 细胞的细胞属于多个簇，表明这些细胞类型是异质的（图 1B）。与NP组织相比，脊索瘤组织中存在较多上皮样细胞，尤其是复发肿瘤中。此外，原发性和复发性脊索瘤均显示软骨细胞、成纤维细胞和内皮细胞比例下降（图 1C）。10 个细胞亚群的代表性基因的表达如图 1D-E 所示。这些结果共同表明上皮样细胞代表肿瘤细胞。

为了定义成纤维细胞亚群，该研究根据特定细胞标记物的表达，确定了脊索瘤和 NP 组织样本中的 6 个主要成纤维细胞亚群（图 2A 和 B）。为了可视化 6 个 CAF 亚组之间的关键差异，作者生成了一个热图，显示每个簇中前 10 个 DEG 的表达水平（图 2C）。在6个成纤维细胞亚群中，成纤维细胞-1和-5仅在脊索瘤中观察到，表明它们是脊索瘤特异性的CAF（图2D）。比较分析表明，CAF、癌细胞和正常成纤维细胞的干性和细胞周期评分没有显着差异（图2E）。功能富集分析表明，CAF 与成纤维细胞和癌细胞具有共同的活性（图 2F），与之前的观察结果一致。在转录组水平上，CAF高表达成纤维细胞（例如COL1A1和COL6A1）和肿瘤细胞（例如SPP1和RARRES21；图 2G）。

2.成纤维细胞聚集揭示了与脊索瘤进展相关的独特亚群

为了识别CAF亚群并阐明其功能，作者进一步对脊索瘤组织中的所有CAF（即成纤维细胞-1和-5细胞）进行了降维分析。该研究确定了 4 个 CAF 亚群（包括 CAF-1、CAF-2、CAF-3 和 CAF-4），其中 CAF-1 和 CAF-2 为主要亚型（图 3A），全部它们高度表达 CAF 的假定标记基因，包括 POSTN、THY1、ACTA2、FBLN1、FAP 和 PDGFRA（图 3B）。该研究生成了一个热图来可视化 4 个 CAF 簇之间的基因表达差异（图 3C）。分析CAF亚群的起源，发现CAF簇2存在于复发肿瘤中，簇3和簇4存在于原发肿瘤组织中，簇1存在于两种肿瘤组织中（图3D）。基于GO富集分析，观察到CAF簇2与ERS反应相关，并以ERS相关和缺氧基因的高表达为特征（HSPA1A，HSPA1B，CCL2，DNAJB1，HSPA6，HIF1A，BAG3，和VEGFA；图3E和F）。发现 CAF 簇 1 与 SPP1、RBP4、AGT、SFRP2 和 ENPP1 高表达的能量代谢相关（图 3E 和G）。CAF 簇 3 与中性粒细胞激活相关，并表达 MMP9、ACP5、CKB、TPM1 和 SERPINE1（图 3E）。CAF 簇 4 主要促进骨骼系统发育，表达 IBSP、IFITM5、DLX5、HHIP、 和 GADD45B（图 3E 和 I）。

3.GSVA 表明 ERS-CAF 特征评分与脊索瘤进展相关

为了验证 ERS-CAF 的促肿瘤作用，该研究对来自脊索瘤患者的 126 个样本进行了总 RNA 测序（图 4A）。使用代表该 CAF 子集的基因集计算每位患者的 ERS-CAF 特征评分，其中包括 ERS 相关基因（例如 HSPA1A、HSPA1B、CCL2 和 DNAJB1）和 CAF 特定标记（例如 THY1、FAP、 和 COL1A1）。ERS-CAF 特征评分与临床数据之间的关系如图 4B 所示。如上所示，ERS-CAF特征评分与肿瘤侵犯周围肌肉（P < 0.0001）、肿瘤分级（P = 0.011）、AJCC分期（P = 0.011）显着相关。P = 0.007）和手术切缘（P = 0.002）。与原发肿瘤患者相比，复发肿瘤患者的 ERS-CAF 特征较高（-0.06 ± 0.53 vs. -0.10 ± 0.51），但这种差异并不具有统计学意义（t = -0.404） ，p = 0.687）。对于生存分析，作者使用在线平台确定ERS-CAF特征评分的阈值，并根据截止点将患者分为高（>截止）和低（≤截止）亚组。Kaplan-Meier 分析表明，ERS-CAF 特征评分的增加可预测不利的 LRFS 和 OS（图 4C），在控制 Cox 多元回归模型中的重要临床因素后，这一结果仍然显着（图4D–E）。这些数据表明使用 GSVA 特征来反映脊索瘤组织中的 ERS-CAF 亚群的可靠性，并强调了 ERS-CAF 在调节肿瘤进展中的重要性。

4.ERS-CAF 可能从多个方面促进脊索瘤进展

为了推断ERS-CAF亚群促进肿瘤进展的可能机制，该研究使用CellChatDB数据库来剖析CAF亚群与其他细胞类型之间的细胞间通讯。结果表明，CAF 亚群（尤其是 ERS-CAF 和 CAF 簇 1）显著激活并与多种细胞相互作用（图 5A 和 B）。鉴定出许多配体-受体对，以证明 ERS-CAF 与脊索瘤中主要细胞类型之间广泛的分子相互作用。对于传入信号，ERS-CAF 主要接受来自 CD46、EFG、SELL、NGF、NRXN 和 HH 分子的信号（图 5D）。在发送信令方面，ERS-CAF 主要产生 TENASCIN、IGF、LIFR、NGF、THBS、GDF 和 JAM 信号（图 5D）。此外，ERS-CAF 被证明是多个细胞通讯网络中的核心细胞，包括 JAM、THBS 和 GDF 信号通路（图 5E），所有这些都已被证明在细胞通讯网络中发挥着重要作用。此外，该研究对 10 个肿瘤组织样本进行了 QIF 检测，以进一步证实 ERS-CAF 与肿瘤细胞之间 JAM2 和 JAM3 的相互作用信号传导。研究发现，JAM2/JAM3 信号在肿瘤细胞靠近 ERS-CAF 的区域表达更多。综上所述，这些数据表明 ERS-CAF 可以通过各种分子机制促进脊索瘤进展。

5.ERS-CAF 与其他细胞类型之间的空间关系

为了进一步剖析脊索瘤组织中 ERS-CAF 的空间特征，该研究对 3 个新鲜肿瘤样本（包括 2 个原发肿瘤和 2 个复发肿瘤）进行了空间转录组测序；图 6A 和 G ）。在 ST 数据中观察到 UMI 和标记基因之间存在很强的相关性（图 6B 和 H），表明质量令人满意。上皮样细胞（KRT8）、单核吞噬细胞（CD14）、T细胞（CD3D）、内皮细胞（）的标记基因PECAM1）、中性粒细胞（CSF3R）、B 细胞（CD79A）、成纤维细胞（COL2A1）和壁细胞（ACTA2）在 ST 数据中检测到（图 6C 和 I）。随后，通过 UMAP 方法降维，在原发性和复发性肿瘤样本中识别出 8 个主要细胞簇（图 6D 和 J）。作者在原发性肿瘤中观察到 CAF 簇 1，而在复发肿瘤标本中观察到 CAF 簇 1 和 ERS-CAF（图 6D 和 J）。这些发现通过 CAF 标记基因表达分析（图 6E 和 K）以及 MIA 结果（图 6F 和 L）得到证实。

 

研究总结

该研究使用 scRNA-seq 对来自 3 个原发肿瘤样本和 3 个复发肿瘤样本的 72 097 个单细胞以及作为对照的 3 个髓核样本进行了测序。在复发性肿瘤中发现了一个独特的 CAF 簇，该簇高度表达缺氧基因，并且在内质网应激 (ERS) 中功能丰富。拟时序分析和细胞通讯分析表明，该ERS-CAF亚群起源于正常成纤维细胞，并与肿瘤和免疫细胞广泛相互作用。通过分析 126 名患者的大量 RNA-seq 数据，研究发现 ERS-CAF 特征评分与脊索瘤的侵袭和不良预后相关。通过将 scRNA-seq 的结果与空间转录组学相结合，证明了脊索瘤组织中 ERS-CAF 的存在，并揭示了这种 CAF 亚型与其周围的肿瘤细胞最接近。在随后涉及 105 名额外患者的 QIF 验证中，研究证实 ERS-CAF 在脊索瘤微环境中丰富且靠近肿瘤细胞。此外，ERS-CAF 密度及其与肿瘤细胞的距离均与肿瘤恶性表型和不良患者预后相关。这些发现描绘了脊索瘤的 CAF 情况，并可能为新型治疗方法的开发提供见解。